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박테리아의 세계

박테리아 20, 배열된 최초의 DNA 게놈의 완전한 유전적 염기서열을 결정 본문

박테리아

박테리아 20, 배열된 최초의 DNA 게놈의 완전한 유전적 염기서열을 결정

사용자 일심(一心) 2019. 2. 25. 10:31

1977년에 Sanger와 동료들은 완전히 배열된 최초의 DNA 게놈인 phage φX174(1)의 완전한 유전적 염기서열을 결정했습니다. 18년 후인 1995년, 우리 팀은 자기복제 박테리아인 해모필러스 인텐젠제(2)의 첫 번째 완전한 유전자 염기서열을 읽을 수 있었습니다. 광범위한 종의 유전자 염기서열을 읽는 것은 이러한 초기 연구로부터 기하급수적으로 증가했습니다. 게놈 정보를 신속하게 디지털화할 수 있는 능력은 지난 25년 동안 8배 이상 증가했습니다(3). 이 모든 새로운 게놈 정보를 이해하려는 노력은 수많은 새로운 컴퓨터 및 실험 패러다임을 만들어냈지만, 우리의 게놈 지식은 여전히 매우 제한적입니다. 어떤 단일 세포 시스템도 그들의 생물학적 역할로 이해되는 모든 유전자를 가지고 있지 않습니다. 단순한 박테리아 세포에서도 염색체는 유전적 레퍼토리를 모두 포함하고 있을까요? 만약 그렇다면, 컴퓨터에 포함된 디지털화된 DNA 염기서열로 시작하는 화학 합성에 의해 완전한 유전체계가 재현될 수 있을까요?

큰 DNA 분자와 염색체의 합성에 대한 우리의 관심은 지난 15년 동안 필수적인 유전자만을 포함하는 최소한의 세포를 만들기 위한 우리의 노력에서 비롯되었습니다. 이 연구는 1995년에 우리가 미코플라스마 제니탈륨의 게놈 염기서열을 분석하면서 시작되었습니다. 박테리아는 실험실에서 독립적인 성장을 할 수 있는 알려진 유기체의 가장 작은 유전자들을 보완하는 박테리아입니다. M.genitalium의 485개 단백질 코드 유전자 중 100개 이상이 한 번에 하나씩 중단되었을 때 불필요합니다(4~6).

우리는 화학적으로 합성된 DNA 카세트로부터 4단계로 화학적으로 합성된 M.게니슘 게놈을 약 6 kb 크기로 조립할 수 있도록 바이러스 크기의 조각들을 조립하는 전략을 개발했습니다. 이는 체외 효소 방법과 사카로미세스 소뇌에서 체내 재조합을 통해 달성되었다. 전체 합성 게놈[582,970 염기쌍(bp)]은 효모 중심 플라스미드(YCp)(7)로 안정적으로 성장했습니다.

몇몇 장애물은 이식하고 화학적으로 합성된 염색체를 수신 세포에서 표현하는데 극복되었습니다. 우리는 효모에서 온전한 염색체를 추출하는 방법을 개선할 필요가 있었습니다. 우리는 또한 이 게놈들을 받는 박테리아 세포에 이식하는 방법을 배워야 했습니다. 합성 게놈에 의해서만 제어되는 세포를 만들기 위해서였죠. M.genitalium은 매우 느린 성장율을 가지고 있기 때문에, 우리는 두 개의 빠르게 성장하는 마이코플라즈마 종, M. mycoides 아종 capri(GM12), 그리고 M. capricolum 아종 capricolum(CK)을 받는 사람으로 바꿨습니다.

효모에서 합성 게놈을 이식하기 위한 조건과 절차를 확립하기 위해, 토종 M. mycoides 게놈(8, 9)을 포함한 박테리아 염색체 전체를 효모에서 백색 플라스미드로 복제하는 방법을 개발했습니다. 하지만, 효모에서 M. mycoides 게놈을 추출하여 M. Capricolum에 이식하려는 초기 시도는 실패했습니다. 기증자와 수령자 마이코플라스마는 공통적인 제한시스템을 공유하고 있다는 것을 발견했습니다. 기증자 게놈은 네이티브 M. 마이코이데스 세포에서 메틸화되었으며, 따라서 모국 기증자 세포로부터 이식하는 동안 제한으로부터 보호되었습니다(10). 그러나, 효모에서 자라는 박테리아 게놈은 메틸화되지 않아 수신 세포의 단일 제한 시스템으로부터 보호되지 않습니다. 우리는 기증자 DNA를 정제된 메틸레이스 또는 조잡한 M. 마이코이드 또는 M. 카프리콜럼 추출물로 메틸화하거나 단순히 수신자 세포의 제한 시스템(8)을 교란시킴으로써 이러한 제한 장벽을 극복하였습니다.

우리는 이제 이전에 확립된 모든 절차를 통합하고 1.08-Mbp M. mycoides JCVI-syn1.0 게놈의 합성, 조립, 복제, 그리고 성공적인 이식 등을 보고하여 이 합성 게놈에 의해 제어되는 새로운 세포를 만들었습니다.

합성 게놈 설계입니다. M. mycoides JCVI-syn1.0 게놈의 설계는 M. mycoides 아종 Capri GMD12(8, 9, 11)의 두 실험실 변종의 고도로 정밀한 완성된 게놈 서열을 기반으로 했습니다. 하나는 Lartigue 등에 의해 사용된 게놈 기증자입니다. [GenBank accession CP001621] (10). 다른 하나는 이스트에서 복제되고 만들어진 게놈의 이식으로 만들어진 변형인 YCpMyc1.1-Δ입니다.IIIres [GenBank accession CP001668] (8) 이 프로젝트는 이러한 시퀀스의 정확성에 크게 좌우되었습니다. 비록 완성된 M. mycoides 게놈 서열을 모두 신뢰할 수 있다고 믿지만, 95개의 다른 사이트가 있습니다. 우리는 두 개의 배열이 끝나기 전에 합성 게놈을 설계하기 시작했습니다. 결과적으로, 대부분의 카세트는 CP001621 시퀀스(11개)를 기반으로 설계되고 합성되었다. 완성이 되었을 때, 우리는 성공적으로 효모로부터 이식된 게놈의 순서를 우리의 디자인 참고 자료로 선택했습니다 (성실하지 않은 타입은 제외).IIIres 유전자. CP001668과 이전에 합성된 카세트 사이에 생물학적으로 중요한 것으로 보이는 모든 차이는 정확히 일치하도록 수정되었습니다(11). 19개 사이트에서 발생한 합성 카세트와 CP001668 사이의 시퀀스 차이는 무해한 것으로 나타나서 수정되지 않았습니다. 이것들은 우리가 효모에 복제하고 효모(8)로부터 게놈 이식의 표준으로 사용한 합성 게놈(JCVI-syn1.0)과 자연(비합성) 게놈(YCpMyc1.1) 사이에 19개의 다형적인 차이를 제공합니다. 합성 게놈과 자연 게놈을 더욱 구별하기 위해 네 가지 워터마크 시퀀스(그림)를 설계했습니다. S1) 지역에서 하나 이상의 카세트를 교체하기 위해 [물 표시 1(1246 bp) 및 2(1081 bp)]을 실험적으로 입증하거나 [물 표시 3(1109 bp) 및 4(1222 bp)]를 예측하여 세포 생존 가능성을 방해하지 않도록 하였습니다. 이러한 워터마크 시퀀스는 펩타이드로 변환을 제한하는 동시에 고유한 식별자를 인코딩합니다. 표 S1에는 합성 게놈과 이 자연 표준 간의 차이점이 나열되어 있습니다. 그림 S2는 M. mycoides JCVI-syn1.0 게놈 지도를 보여준다. M. mycoide JCVI syn1.0의 카세트 및 조립 중간 경계, 워터마크, 삭제, 삽입 및 유전자는 그림으로 표시됩니다. S2 및 이식된 mycoplasma Clone sMmYCp235-1의 시퀀스가 GenBank(액세스 CP002027)에 제출되었습니다.

합성 게놈 조립 전략입니다. 설계된 카세트는 일반적으로 1080bp이며 80bp가 인접한 카세트(11개)와 겹칩니다. 그것들은 모두 블루 헤론이 화학적으로 합성한 올리고뉴클레오티드의 조립에 의해 생산되었습니다. 각 카세트는 제조업체에서 개별적으로 합성하고 시퀀스를 확인했습니다. 건물 공정을 지원하기 위해, DNA 카세트 및 조립 매개체는 종단면에서의 Not I 제한 부지를 포함하도록 설계되었고, 효모에서의 성장과 선택을 위해 벡터 요소가 존재하는 상태에서 재결합되었다(7, 11). 1078 1kb 카세트로부터 효모에 있는 변형과 동질적 재조합에 의해 게놈을 3단계로 조립하는 계층적 전략이 설계되었다.

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